毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis, CE)又叫毛細(xì)管電泳(HPCE), 是近年來(lái)發(fā)展zui快的分析方法之一。1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75μm內(nèi)徑毛細(xì)管柱內(nèi)用高電壓進(jìn)行分離, 創(chuàng)立了現(xiàn)代毛細(xì)管電泳。1984年Terabe等建立了膠束毛細(xì)管電動(dòng)力學(xué)色譜。1987年Hjerten 建立了毛細(xì)管等電聚焦, Cohen和Karger提出了毛細(xì)管凝膠電泳。1988～1989年出現(xiàn)了*批毛細(xì)管電泳商品儀器。短短幾年內(nèi), 由于CE符合了以生物工程為代表的生命科學(xué)各領(lǐng)域中對(duì)多肽、蛋白質(zhì)(包括酶，抗體)、核苷酸乃至脫氧核糖核酸(DNA)的分離分析要求, 得到了迅速的發(fā)展。

　　CE是經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物。CE和液相色譜法(HPLC)相比, 其相同處在于都是分離技術(shù), 儀器操作均可自動(dòng)化, 且二者均有多種不同分離模式。二者之間的差異在于：CE用遷移時(shí)間取代HPLC中的保留時(shí)間, CE的分析時(shí)間通常不超過(guò)30min, 比HPLC速度快；對(duì)CE而言, 從理論上推得其理論塔板高度和溶質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)成正比, 對(duì)擴(kuò)散系數(shù)小的生物大分子而言, 其柱效就要比HPLC高得多；CE所需樣品為nl級(jí), zui低可達(dá)270fl, 流動(dòng)相用量也只需幾毫升, 而HPLC所需樣品為μl級(jí), 流動(dòng)相則需幾百毫升乃至更多；但CE僅能實(shí)現(xiàn)微量制備, 而HPLC可作常量制備。

　　CE和普通電泳相比, 由于其采用高電場(chǎng), 因此分離速度要快得多；檢測(cè)器則除了未能和原子吸收及紅外光譜連接以外, 其它類型檢測(cè)器均已和CE實(shí)現(xiàn)了連接檢測(cè)；一般電泳定量精度差,而CE和HPLC相近；CE操作自動(dòng)化程度比普通電泳要高得多?？傊? CE的優(yōu)點(diǎn)可概括為三高二少：高靈敏度, 常用紫外檢測(cè)器的檢測(cè)限可達(dá)10-13～10-15mol,激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器則達(dá)10-19～10-21mol；高分辨率, 其每米理論塔板數(shù)為幾十萬(wàn)；高者可達(dá)幾百萬(wàn)乃至千萬(wàn), 而HPLC一般為幾千到幾萬(wàn)；高速度, zui快可在60s內(nèi)完成, 在250s內(nèi)分離10種蛋白質(zhì), 1.7min分離19種陽(yáng)離子, 3min內(nèi)分離30種陰離子； 樣品少, 只需nl (10-9 L)級(jí)的進(jìn)樣量；成本低, 只需少量(幾毫升)流動(dòng)相和價(jià)格低廉的毛細(xì)管。由于以上優(yōu)點(diǎn)以及分離生物大分子的能力, 使CE成為近年來(lái)發(fā)展zui迅速的分離分析方法之一。當(dāng)然CE還是一種正在發(fā)展中的技術(shù), 有些理論研究和實(shí)際應(yīng)用正在進(jìn)行與開(kāi)發(fā)。 

　　“CE"統(tǒng)指以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力, 以毛細(xì)管為分離通道, 依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)。（見(jiàn)圖16 毛細(xì)管電泳儀器示意圖）。其儀器結(jié)構(gòu)包括一個(gè)高壓電源, 一根毛細(xì)管, 一個(gè)檢測(cè)器及兩個(gè)供毛細(xì)管兩端插入而又可和電源相連的緩沖液貯瓶。在電解質(zhì)溶液中, 帶電粒子在電場(chǎng)作用下, 以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現(xiàn)象叫電泳。

　　CE所用的石英毛細(xì)管柱, 在pH>3情況下, 其內(nèi)表面帶負(fù)電, 和溶液接觸時(shí)形成了一雙電層。在高電壓作用下, 雙電層中的水合陽(yáng)離子引起流體整體地朝負(fù)極方向移動(dòng)的現(xiàn)象叫電滲, 粒子在毛細(xì)管內(nèi)電解質(zhì)中的遷移速度等于電泳和電滲流(EOF)兩種速度的矢量和, 正離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流一致, 故zui先流出；中性粒子的電泳流速度為“零"，故其遷移速度相當(dāng)于電滲流速度；負(fù)離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流方向相反, 但因電滲流速度一般都大于電泳流速度, 故它將在中性粒子之后流出, 從而因各種粒子遷移速度不同而實(shí)現(xiàn)分離。

　　電滲是CE中推動(dòng)流體前進(jìn)的驅(qū)動(dòng)力, 它使整個(gè)流體像一個(gè)塞子一樣以均勻速度向前運(yùn)動(dòng), 使整個(gè)流型呈近似扁平型的“塞式流"。（見(jiàn)圖）它使溶質(zhì)區(qū)帶在毛細(xì)管內(nèi)原則上不會(huì)擴(kuò)張。但在HPLC中,采用的壓力驅(qū)動(dòng)方式使柱中流體呈拋物線型, 其中心處速度是平均速度的兩倍, 導(dǎo)致溶質(zhì)區(qū)帶本身擴(kuò)張, 引起柱效下降, 使其分離效率不如CE。

　　理論分析表明, 增加速度是減少譜帶展寬、提率的重要途徑, 增加電場(chǎng)強(qiáng)度可以提高速度。但高場(chǎng)強(qiáng)導(dǎo)致電流增加, 引起毛細(xì)管中電解質(zhì)產(chǎn)生焦耳熱(自熱)。自熱將使流體在徑向產(chǎn)生拋物線型溫度分布, 即管軸中心溫度要比近壁處溫度高。因溶液粘度隨溫度升高呈指數(shù)下降, 溫度梯度使介質(zhì)粘度在徑向產(chǎn)生梯度, 從而影響溶質(zhì)遷移速度, 使管軸中心的溶質(zhì)分子要比近管壁的分子遷移得更快, 造成譜帶展寬, 柱效下降。

　　一般來(lái)說(shuō)溫度每提高1℃, 將使淌度增加2% (所謂淌度, 即指溶質(zhì)在單位時(shí)間間隔內(nèi)和單位電場(chǎng)上移動(dòng)的距離)。此外, 溫度改變使溶液pH值、粘度等發(fā)生變化, 進(jìn)一步導(dǎo)致電滲流、溶質(zhì)分子的電荷分布(包括蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu))、離子強(qiáng)度等的改變, 造成淌度改變、重復(fù)性變差、柱效下降等現(xiàn)象。降低緩沖液濃度可降低電流強(qiáng)度, 使溫差變化減小。高離子強(qiáng)度緩沖液可阻止蛋白質(zhì)吸附于管壁, 并可產(chǎn)生柱上濃度聚焦效應(yīng), 防止峰擴(kuò)張, 改善峰形。減小管徑在一定程度上緩解了由高電場(chǎng)引起的熱量積聚, 但細(xì)管徑使進(jìn)樣量減少, 造成進(jìn)樣、檢測(cè)等技術(shù)上的困難。因此, 加快散熱是減小自熱引起的溫差的重要途徑。液體的導(dǎo)熱系數(shù)要比空氣高100倍?，F(xiàn)在有的采用液體冷卻方式的毛細(xì)管電泳儀可使用離子強(qiáng)度高達(dá)0.5mol/L的緩沖液進(jìn)行分離, 或使用200 μm直徑的毛細(xì)管進(jìn)行微量制備, 仍能達(dá)到良好的分離效果和重現(xiàn)性。 

　?。茫努F(xiàn)有六種分離模式，分述如下： 

　　1. 毛細(xì)管區(qū)帶電泳(capillary zone electrophoresis, CZE), 又稱毛細(xì)管自由電泳, 是CE中zui基本、應(yīng)用zui普遍的一種模式。前述基本原理即是CZE的基本原理。 

　　2. 膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜 (micellar electrokinetic capillary chromatography, MECC), 是把一些離子型表面活性劑 (如十二烷基硫酸鈉, SDS) 加到緩沖液中, 當(dāng)其濃度超過(guò)臨界濃度后就形成有一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠束。雖然膠束帶負(fù)電, 但一般情況下電滲流的速度仍大于膠束的遷移速度, 故膠束將以較低速度向陰極移動(dòng)。溶質(zhì)在水相和膠束相(準(zhǔn)固定相)之間產(chǎn)生分配, 中性粒子因其本身疏水性不同, 在二相中分配就有差異, 疏水性強(qiáng)的膠束結(jié)合牢, 流出時(shí)間長(zhǎng), zui終按中性粒子疏水性不同得以分離。MECC使CE能用于中性物質(zhì)的分離, 拓寬了CE的應(yīng)用范圍, 是對(duì)CE極大的貢獻(xiàn)。 

　　3. 毛細(xì)管凝膠電泳 (capillary gel electrophoresis, CGE) 是將板上的凝膠移到毛細(xì)管中作支持物進(jìn)行的電泳。凝膠具有多孔性,起類似分子篩的作用, 溶質(zhì)按分子大小逐一分離。凝膠粘度大, 能減少溶質(zhì)的擴(kuò)散, 所得峰形尖銳, 能達(dá)到CE中zui高的柱效。常用聚丙烯酰胺在毛細(xì)管內(nèi)交聯(lián)制成凝膠柱, 可分離、測(cè)定蛋白質(zhì)和DNA的分子量或堿基數(shù), 但其制備麻煩, 使用壽命短。如采用粘度低的線性聚合物如甲基纖維素代替聚丙烯酰胺, 可形成無(wú)凝膠但有篩分作用的無(wú)膠篩分(Non-Gel Sieving)介質(zhì)。它能避免空泡形成, 比凝膠柱制備簡(jiǎn)單,壽命長(zhǎng), 但分離能力比凝膠柱略差。CGE和無(wú)膠篩分正在發(fā)展成第二代DNA序列測(cè)定儀, 將在人類基因組織計(jì)劃中起重要作用。 

　　4. 毛細(xì)管等電聚焦 (capillary isoelectric focusing, CIEF) 將普通等電聚焦電泳轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行。通過(guò)管壁涂層使電滲流減到zui小, 以防蛋白質(zhì)吸附及破壞穩(wěn)定的聚焦區(qū)帶, 再將樣品與兩性電解質(zhì)混合進(jìn)樣, 兩端貯瓶分別為酸和堿。加高壓(6～8kV)3～5min后, 毛細(xì)管內(nèi)部建立pH梯度,蛋白質(zhì)在毛細(xì)管中向各自等電點(diǎn)聚焦, 形成明顯的區(qū)帶。zui后改變檢測(cè)器末端貯瓶?jī)?nèi)的pH值, 使聚焦的蛋白質(zhì)依次通過(guò)檢測(cè)器而得以確認(rèn)。 

　　5. 毛細(xì)管等速電泳 (capillary isotachor-phoresis,,CITP) 是一種較早的模式, 采用先導(dǎo)電解質(zhì)和后繼電解質(zhì), 使溶質(zhì)按其電泳淌度不同得以分離, 常用于分離離子型物質(zhì), 目前應(yīng)用不多。 

　　6. 毛細(xì)管電色譜 (capillary electrochromatography, CEC) 是將HPLC中眾多的固定相微粒填充到毛細(xì)管中, 以樣品與固定相之間的相互作用為分離機(jī)制, 以電滲流為流動(dòng)相驅(qū)動(dòng)力的色譜過(guò)程, 雖柱效有所下降, 但增加了選擇性。此法有發(fā)展前景。 

　　毛細(xì)管電泳 (CE) 除了比其它色譜分離分析方法具有效率更高、速度更快、樣品和試劑耗量更少、應(yīng)用面同樣廣泛等優(yōu)點(diǎn)外, 其儀器結(jié)構(gòu)也比液相色譜 (HPLC) 簡(jiǎn)單。CE只需高壓直流電源、進(jìn)樣裝置、毛細(xì)管和檢測(cè)器。前三個(gè)部件均易實(shí)現(xiàn), 困難之處在于檢測(cè)器。特別是光學(xué)類檢測(cè)器, 由于毛細(xì)管電泳溶質(zhì)區(qū)帶的超小體積的特性導(dǎo)致光程太短, 而且圓柱形毛細(xì)管作為光學(xué)表面也不夠理想, 因此對(duì)檢測(cè)器靈敏度要求相當(dāng)高。

　　當(dāng)然在CE中也有利于檢測(cè)的因素, 如：在HPLC中, 因稀釋之故,溶質(zhì)到達(dá)檢測(cè)器的濃度一般是其進(jìn)樣端原始濃度的1%, 但在CE中, 經(jīng)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件后, 可使溶質(zhì)區(qū)帶到達(dá)檢測(cè)器時(shí)的濃度和在進(jìn)樣端開(kāi)始分離前的濃度相同。而且CE中還可采用堆積等技術(shù)使樣品達(dá)到柱上濃縮效果, 使初始進(jìn)樣體積濃縮為原體積的1/10～1%, 這對(duì)檢測(cè)十分有利。因此從檢測(cè)靈敏度的角度來(lái)說(shuō), HPLC具有良好的濃度靈敏度, 而CE提供了很好的質(zhì)量靈敏度。總之, 檢測(cè)仍是CE中的關(guān)鍵問(wèn)題,有關(guān)研究報(bào)道很多, 發(fā)展也很快。迄今為止, 除了原子吸收光譜、電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP)及紅外光譜未用于CE外, 其它檢測(cè)手段如：紫外、熒光、電化學(xué)、質(zhì)譜、激光等類型檢測(cè)器均已用于CE。 

　　與HPLC類似, CE中應(yīng)用zui廣泛的是紫外/可見(jiàn)檢測(cè)器。按檢測(cè)方式可分為固定波長(zhǎng)或可變波長(zhǎng)檢測(cè)器和二極管陣列或波長(zhǎng)掃描檢測(cè)器兩類。前一類檢測(cè)器采用濾光片或光柵來(lái)選取所需檢測(cè)波長(zhǎng), 優(yōu)點(diǎn)在于結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單, 靈敏度比后一類檢測(cè)器高；后一類檢測(cè)器能提供時(shí)間--波長(zhǎng)--吸光度的三維圖譜, 優(yōu)點(diǎn)在于在線紫外光譜可用來(lái)定性、鑒別未知物。有些商用儀器的二極管陣列檢測(cè)器還可做到在線峰純度檢查, 即在分離過(guò)程中便可得知每個(gè)峰含有幾種物質(zhì)；缺點(diǎn)在于靈敏度比前一類略差。采用快速掃描的光柵獲取三維圖譜方式時(shí), 其掃描速度受到機(jī)械動(dòng)作速度的限制。用二極管陣列方式, 掃描速度受到計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)存貯容量大小的限制。由于CE的峰寬較窄, 理論上要求能對(duì)zui窄的峰采集20個(gè)左右的數(shù)據(jù), 因此要很好地選取掃描頻率, 才能得到理想的結(jié)果。

　　毛細(xì)管電泳基本原理

　　毛細(xì)管電泳（Capillary Electrophoresis，CE ）是八十年代后期在范圍內(nèi)迅速崛起的一種分離分析技術(shù)。具有快速、、高靈敏度、易定量、重現(xiàn)性好及自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛地應(yīng)用于小分子、小離子、多肽及蛋白質(zhì)的分離分析研究。它又在核酸分離方面顯示出巨大的潛力。電流通過(guò)導(dǎo)體時(shí)產(chǎn)生焦耳熱。傳統(tǒng)平板凝膠電泳的zui大局限性在于其無(wú)法克服兩端高電壓帶來(lái)的焦耳熱所產(chǎn)生的負(fù)面影響。焦耳熱可使篩分介質(zhì)內(nèi)部出現(xiàn)溫度、粘度及分離速度的不均一，影響遷移、降低效率、使區(qū)帶變寬。由于這種負(fù)面影響與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，所以極大地限制了高電壓的引入。也難以提高電泳速度。毛細(xì)管電泳使樣品在一根極細(xì)的柱子中進(jìn)行分離。細(xì)柱可減小電流，使焦耳熱的產(chǎn)生減少；同時(shí)又增大了散熱面積，提高散熱效率，大大降低了管中心與管壁間的溫差，減少了柱子徑向上的各種梯度差，保證了分離。因此可以加大電場(chǎng)強(qiáng)度，達(dá)到100～200V/cm，全面提高分離質(zhì)量。 

　　毛細(xì)管電泳的基本裝置是一根充滿電泳緩沖液的毛細(xì)管和與毛細(xì)管兩端相連的兩個(gè)小瓶微量樣品從毛細(xì)管的一端通過(guò)“壓力"或“電遷移"進(jìn)入毛細(xì)管。電泳時(shí)，與高壓電源連接的兩個(gè)電極分別浸人毛細(xì)管兩端小瓶的緩沖液中。樣品朝與自身所帶電荷極性相反的電極方向泳動(dòng)。各組分因其分子大小、所帶電荷數(shù)、等電點(diǎn)等性質(zhì)的不同而遷移速率不同，依次移動(dòng)至毛細(xì)管輸出端附近的光檢測(cè)器，檢測(cè)、記錄吸光度，并在屏幕上以遷移時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)將各組分以吸收峰的形式動(dòng)態(tài)直觀地記錄下來(lái)。